Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen yang Terpotong

Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi
Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen yang Terpotong

Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA
polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya. Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1).
Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung
blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda.
Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded,
sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung. Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis
yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%. Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern hybridization. Adapun tahapannya yaitu:
1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membrane nilon.
2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan
autoradiography.