Home | Looking for something? Sign In | New here? Sign Up | Log out

Laman

Rabu, 02 Juni 2010

AKTIVITAS DAN APLIKASI ENZIM PADA RISET DNA REKOMBINAN

Rabu, 02 Juni 2010

AKTIVITAS DAN APLIKASI ENZIM PADA RISET DNA REKOMBINAN

Teknologi DNA rekombinan merupakan salah satu faktor yang berkontribusi dalam perkembangan pengetahuan ekspresi gen. Teknologi DNA rekombinan pertama kali dilakukan sekitar tahun 1970 – 1980-an. Dasar dari teknologi DNA rekombinan adalah manipulasi molekul DNA dalam tabung uji. Teknik DNA rekombinan ini melibatkan enzim – enzim yang aktivitasnya dapat diketahui dan dikontrol. Enzim – enzim tersebut terbagi dalam empat golongan besar, yaitu :

1. DNA polimerase

Enzim yang mensintesis polinukleotida baru yang komplemen dengan DNA atau RNA template.enzim ini digunakan dalam PCR, sekuensing DNA, pelabelan DNA dan riset – riset biomol lain. Ada 2 peran eksonuklese dari DNA polimerase yaitu :

a. Eksonuklese 3’- 5’: berfungsi menghilangkan nukleotida dari ujung 3’ pada untai DNA yang baru disintesis aktivitasnya disebut proofreading karena eksonuklese ini membiarkan DNA polimerase mengoreksi kesalahan insersi basa yang tidak pada tempatnya.

b. Eksonuklease 5’ - 3’: biasanya berfungsi pada replikasi DNA, yaitu untuk menghilangkan sedikit bagian dari polinukleotida yang sudah disisipkan ke untai template.

2. Nuklease

Enzim yang berfungsi untuk memutus ikatan fosfodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan yang lain. Ada 3 macam nuklease :

a. Eksonuklease, menghilangkan nukleotida dari ujung molekul DNA atau RNA.

b. Endonuklease, aktivitasnya memotong ikatan fosfodiester internal.

c. Restriksi endonuklease, mempunyai peran khusus dalam teknologi DNA rekombinan, yaitu dapat mengikat DNA pada urutan tertentu dan membuat untai ganda DNA terpotong dalam urutan tertentu. Gambar 2. Aktivitas enzim Nuklease

3. Ligase

Tahap penting dalam teknologi DNA rekombinan adalah penyambungan molekul DNA asing ke DNA vektor. Proses ini disebut proses ligasi dan dikatalisis oleh enzim ligase. Ligase adalah enzim yang berperan dalam menyambung ikatan kovalen antara gula dan fosfat. Contoh enzim ligase: enzim ligase dar E. coli dan faga T4. Ligase lebih efisien menyambung ujung lengket (sticky end) dibandingkan menyambung ujung tumpul sebab interaksi ikatan hidrogen antara tonjolan ujung lengket (sticky) menambah stabilitas kedua untai ketika proses katalisis berlangsung; interaksi seperti itu tidak terjadi pada proses ligase ujung tumpul (blunt end) sehingga proses ligasi menjadi tidak efisien. Hasil reaksi ligasi antara vektor (plasmid) dan fragmen DNA setelah dipotong enzim restriksi yang sama, sebagai berikut :

a. Vektor berhasil disisipi fragmen DNA asing bukan target

b. Vektor berhasil disispi fragmen DNA asing target

c. Vektor tidak berhasil disisipi dan menyambung kembali (religasi)

4. Enzim modifikasi akhir

Contoh dari enzim modifikasi akhir yaitu:

a. Terminal deoksinukleotidil transferase Berfungsi untuk membentuk ujung DNA yang homopolimer

b. Alkaline fosfatase Berfungsi untuk menghilangkan fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang mencegah molekul ini berligasi

c. Polinukleotida kinase Kebalikan dari alkaline fosfatase yaitu menmbahkan fosfat pada ujung 5’.

0 komentar:

Posting Komentar