DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan [1]. Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA [2]. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati [3]. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional [4].
Jenis-Jenis DNA Ligase
DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD+ atau ATP. DNA ligase NAD+-dependent ditemukan hanya di bakteri. Sementara itu, DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus. Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang berbeda, keduanya memiliki mekanisme katalitik yang sama. DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase [1][2].
T4 DNA Ligase
T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1 mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu. Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C. Sementara itu, jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam [5].
T7 DNA Ligase
T7 DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 KDa. DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar [2].
Mekanisme DNA Ligase
Mekanisme DNA Ligase
Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD+. Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate [1].
2 komentar:
Hello there! Thank you for sharing your thoughts about t7 in your area. I am glad to stop by your site and know more about T7. Keep it up! This is a good read. I will be looking forward to visit your page again and for your other posts as well.
One vital aspect to performing efficient recombination experiments involving the ligation of cohesive-ended fragments is controlling the optimal temperature. Most experiments use T4 DNA Ligase (isolated from bacteriophage T4), which is most active at 25°C. However, for optimal ligation efficiency with cohesive-ended fragments ("sticky ends"), the optimal enzyme temperature needs to be balanced with the melting temperature Tm (also the annealing temperature) of the sticky ends being ligated. If the ambient temperature exceeds Tm, the homologous pairing of the sticky ends would not be stable because the high temperature disrupts hydrogen bonding. Ligation reaction is most efficient when the sticky ends are already stably annealed, disruption of the annealing ends would therefore results in low ligation efficiency. The shorter the overhang, the lower the Tm, typically a 4-base overhang has a Tm of 12-16°C.
A 3.0 µL sample of enzyme was analyzed at OD280 using a Nanodrop ND-1000 spectrophotometer standardized using a 2.0 mg/ml BSA sample (Pierce Cat #23209) and blanked with product storage solution. The observed average measurement of 3 replicate samples was converted to mg/mL using an extinction coefficient of 67,850 and molecular weight of 41,132 Daltons. Acceptance for this assay is +/- 5% of reference sample.
In biochemistry, ligase, also called synthetase, is an enzyme catalyzing the joining of two large molecules through the formation of a new chemical bond such as C-O, C-S, C-N, or the linking together of two compounds, usually accompanied with the hydrolysis of a small attached chemical group to one of the larger molecules. ligase introduction
Posting Komentar